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蛋白酶K的来源分享
点击次数:91 发布时间:2019-04-16
   蛋白酶K是一种从白色念 珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶,具有很高 的比活性,是DNA提取的关键试剂。该酶 在较广的pH范围(4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)均有活性,用于质粒或基因组 DNA、RNA的分离。在DNA提取中,主 要作用是酶解与核酸结合的组蛋白,使 DNA游离在溶液中,随后用不同方法进行 抽提,除去杂质,收集DNA。EDTA等螯 合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。蛋 白酶K忙存液一般为10mg/ml或20mg/ml。 贮存于一20°C。蛋白酶K溶液为无色透明, 如出现沉淀就不能再使用

  从林伯氏白色念球菌(tritirachium album limber)中纯化得到。据资料显示:该酶有两个Ca2+结合位点,它们离酶的活性中心有一定距离,与催化机理并无直接关系。然而,如果从该酶中除去Ca2+,由于出现远程的结构变化,催化活性将丧失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以,蛋白酶k消化过程中通常加入EDTA(以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白,如角蛋白一类,则可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA(ph8.0)至终浓度为2mmol/l,以鳌合Ca2+。

  蛋白酶K,是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定,还具有降解天然蛋白质的能力,因而它应用很广泛,包括制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50-100μg/ml。在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。

  推荐反应缓冲液:50mMTris-HCl(pH7。5),10mM CaCl2 。

  蛋白酶K配制标准:20mg/ml蛋白酶K配制标准(proteinase K):将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20℃。

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